【摘要】目的:制备硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液,并对其性质进行考察。方法:以注射用大豆油和注射用中链脂肪酸三酰甘油为混合油相,以蛋黄卵磷脂、泊洛沙姆188和聚山梨酯-80为复合乳化剂,采用高压均质法制备硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液,通过粒度和粒度分布、Zeta 电位、pH值、渗透压和含量测定以及稳定性考察等对其性质进行研究。结果:制备的乳剂外观为乳白色,略带蓝色乳光。3批样品的粒径分别为(158±22) 、(160±22)和( 161±33)nm,平均Zeta 电位为(-37.70±0.79) mV,平均pH 值为(7.51±0.03) ,平均渗透压为( 279.33 ± 0.58) mmol•kg-1,平均含量为( 99.19±1.68) %,在( 6±2) 和(25±2)℃条件下放置6个月稳定。结论:制备工艺可行,制剂理化性质稳定,符合静脉注射要求。
硫酸氢氯吡格雷(clopidogrel bisulfate,CLB)为二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)受体抑制剂,能选择性地抑制ADP 与血小板受体的结合,进而抑制ADP与糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物的激活,从而抑制血小板的聚集。临床上主要用于治疗不稳定心绞痛、急性脑梗死、急性缺血性脑卒中、急性心梗死、以及短暂性缺血等病症。目前CLB在临床应用上只有口服制剂。由于CLB在中性pH 中几乎不溶于水,其溶解度具有很强的pH依赖性,且在水溶液中不稳定,易降解,因此,制备其注射用制剂有一定困难。目前,多采用增溶剂增加其溶解度或者冻干等方法研究其静脉给药制剂。
亚微乳(submicron emulsion)是一种主要以植物油为油相,以磷脂为乳化剂的O/W型乳剂。亚微乳的粒径在100~1000 nm之间,外观不透明,呈浑浊或乳状,属于热力学不稳定体系。亚微乳可供静脉注射用,是脂溶性药物的良好载体,不仅具有增加药物稳定性、减轻不良反应、靶向释药作用、易于实现工业化等特点,还能提供适当的能量和必需脂肪酸,现已广泛应用于临床中。
本研究采用高压均质法制备了硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液,并对其粒度和粒度分布、Zeta 电位、pH值、渗透压和含量以及稳定性进行了考察,旨在为CLB用于注射剂的研究提供参考。
仪器与试药
B25实验室高剪切分散乳化机(上海贝而特机电设备科技有限公司);AH100D高压均质机(ATS Engineering Inc. );PF-101S 集热式恒温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司);立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医药设备厂);AR1140 电子分析天平(Ohaus Crop. Pine Brook,NJ,USA);PHS-3CW 酸度计(上海理达仪器厂);Coulter LS230 激光粒度分析仪(Bekman Coulter Co.Ltd.,USA); DELSA 440 SX 电位-粒度分析仪(Bekman Coulter Co. Ltd.,USA);Vapro@ 5520渗透压仪(Wescor,Inc.);高效液相色谱仪(SPD- M20A 检测器、LC-20AT泵、LCsolution工作站,日本岛津公司); 4802H紫外可见分光光度计(Unico InstrumentsCo.,Ltd. );CS 120GXL型微量超速离心机(日本日立公司); 80-2 型离心机(金坛大地自动化仪器厂);101-2AB 型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。
硫酸氢氯吡格雷( 北京双鹤药业股份有限公司,批号: CP090924)。蛋黄卵磷脂(PL-100M,日本丘比株式会社);注射用大豆油(LCT,铁岭北亚药用油有限责任公司); 注射用中链脂肪酸三酰甘油(MCT,广州汉方现代中药研究开发有限公司);聚山梨酯-80(Tween-80,天津市博迪化工有限公司);泊洛沙姆188(F-68,德国BASF公司);注射用甘油(浙江遂昌甘油厂);甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
方法与结果
1 硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液的处方和制备工艺考察
在预实验的基础上初步拟定处方和制备工艺,并以外观、粒度和粒度分布对主要制备工艺参数进行优化考察。
1.1 制备工艺考察
1.1.1 初乳条件考察 本研究使用高剪切分散法制备初乳,对分散转速、分散时间和分散温度进行考察。
本研究利用苏丹红只溶于油,不溶于水的性质,判断初乳中是否存在油滴,进而确定最佳初乳条件。将苏丹红加入初乳中,轻轻振摇,如果初乳中有油滴,苏丹红会溶解在油滴中,观察到红色油点;如果初乳中没有油滴,则苏丹红不溶,观察到红色固状物沉淀。以10 min内是否出现红色油点为判断标准,(“+”越多表示红色油点越多,(“-”表示未观察到红色油点,分散时间为每次3 min,分散3次,分散温度50~60 ℃,考察分散转速10000~19 000 r•min-1对初乳的影响。 结果表明,随着分散转速的增加,初乳油滴减少,当分散转速达16000 r•min-1以上时,初乳无油滴。但分散转速达19000 r•min-1时,分散不足1 min即有大量(“白烟”产生,怀疑是分散转速太高,分散过程瞬间产生大量热量所致。因此,选择分散转速为16000 r•min-1。
分散转速16 000 r•min-1,分散温度50~60 ℃,考察分散时间对初乳的影响。结果表明,分散时间对初乳有一定影响,分散时间过短,不足以将油相完全包裹在水相中,有油滴产生; 分散时间过长,会在分散过程中产生大量热量,使乳剂发生聚集,不稳定,出现油滴。因此,选择分散时间为每次3 min,分散3次。 分散转速16 000 r•min-1,分散时间为每次3 min,分散3次,考察分散温度对初乳的影响,结果表明,分散温度控制在50~60 ℃较适宜。因此,选择分散温度为50~60 ℃。
1.1.2 均质条件考察 本研究采用高压均质法制备乳剂,在均质温度40 ℃条件下,对均质压力和均质次数进行考察。
选择均质压力分别为400,500,600,700,800,900,1000 bar,均质次数5次,制备硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液,测定其粒度和粒度分布,结果表明,随着均质压力的增大,乳剂粒径减小,当压力达到700 bar时,进一步增加压力,粒径无显著性变化。因此,选择均质压力为700 bar。
均质压力为700 bar,考察均质次数对乳剂粒度及粒度分布的影响,结果表明,均质3次后进一步增加均质次数,粒径虽有所降低,但降低幅度减小。当均质5次以后,粒度分布随均质次数的增加无显著性变化。因此,选择均质次数为5次。
1.2 硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液的制备
将2.5%(w /v)注射用甘油、0.2%(w /v)F-68和0.2%(W /v)Tween-80加入到适量的注射用水中,60~70 ℃磁力搅拌,完全溶解,作为水相。将1.2%(w /v)蛋黄卵磷脂分散于7%(w /v)LCT和3%(w /v)MCT混合液中,磁力搅拌至分散均匀,60~70 ℃磁力搅拌下加入配方量的硫酸氢氯吡格雷,至完全溶解,作为油相。将油相趁热加入到水相中,在50~60 ℃下,用高剪切分散机分散,16000 r•min-1,分散3次,每次3 min,制得初乳。加水至配方量,转移至高压均质机中,40 ℃,700 bar,均质5次,调节pH值至8.0,0.45 μm微孔滤膜过滤,灌装、充氮气,121℃灭菌15 min,即制得硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液。
2 含量测定
2.1 色谱条件
色谱柱:DianmonsilTMC18柱(200 mm × 4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.01 mol•L-1磷酸盐缓冲液(70∶30,磷酸调pH 值至3.0);柱温:室温;检测波长:227 nm;流速:1.0 mL•min-1;进样量:20 μL。
2.2 标准曲线的绘制
精密称取硫酸氢氯吡格雷标准品适量,用甲醇溶解,配制成相当于氯吡格雷250 μg•mL-1的溶液,作为储备液;精密移取一定量的储备液,用甲醇稀释,分别配成1,5,25,50,100 μg•mL-1的溶液,即得氯吡格雷系列标准溶液。分别将上述标准溶液注入高效液相色谱仪中,记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标,浓度(C,μg•mL-1)为横坐标,得回归方程:A = 39016C -34830(r = 0.9999)。结果表明,氯吡格雷在1~100 μg•mL-1范围内浓度与峰面积线性关系良好。精密度和稳定性的RSD 均<2%,回收率为100.69%(n = 9)。
2.3 含量测定
精密量取硫酸氢氯吡格雷亚微乳0.1 mL,置于10 mL量瓶中,加入甲醇破乳,稀释并定容至刻线,混匀,得澄清溶液。经0.22 μm微孔滤膜过滤,进样,记录色谱图,外标法计算含量。测得3批样品的平均含量为(99.19±1.68)%。
3 性质考察
3.1 性状
本品为白色或类白色均匀乳状液体,略带蓝色乳光。
3.2 粒度和粒度分布的测定
将硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液用纯净水稀释10倍,采用Coulter LS230激光粒度分析仪测定其粒度和粒度分布。3批样品的粒度分别为:(158±22),(160±22 ),(161±33 )nm。
3.3 Zeta电位的测定
将硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液用纯净水稀释200倍,采用DELSA 440 SX电位-粒度分析仪测定其Zeta电位。3批样品的平均Zeta电位为:(-37.70±0.79)mV。
3.4 pH值测定
采用PHS-3CW酸度计测定硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液的pH值。3批样品的平均pH值为(7.51±0.03)。
3.5 渗透压测定
采用Vapro@ 5520渗透压仪测定硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液的渗透压。3批样品的平均渗透压为(279.33±0.58)mmol•kg-1。
4 稳定性考察
4.1 离心稳定性
取硫酸氢氯吡格雷亚微注射液乳样品,以4000r•min-1离心15 min,未见分层现象;然后以15000r•min-1离心10 min,未见分层现象。
4.2 冻融稳定性
冻融试验(冷冻加热循环实验)用于考察分散体系对温度变化的耐受性。
取硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液样品,于-20 ℃冰箱中冷冻12 h,取出于室温放置12 h,此为一个冻融循环。如此进行3次冻融循环,观察其外观并测定其粒度和粒度分布。
4.3 放置稳定性
亚微乳属于热力学不稳定体系,长期贮存过程中可能出现破乳、分层等现象,所以对3批硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液进行了在(6±2),(25±2)和(40±2)℃条件下放置6个月的稳定性考察,分别于0,1,2,3,6月取样,观察其外观,测定其粒度和粒度分布以及含量,结果见表5~7。结果表明,在(6±2)和(25±2)℃条件下放置6个月,外观、粒度和粒度分布以及含量均无明显变化;在(40±2)℃条件下放置3个月,乳剂颜色变黄、略有挂壁的现象,含量下降明显,故停止稳定性考察。
讨论
本实验所制得的硫酸氢氯吡格雷亚微乳剂平均粒度在160 nm左右,平均Zeta电位在-37.70 mV左右,该粒度分布可使乳剂在较长时间内保持其物理稳定性。乳滴表面所带负电荷可使乳滴之间产生相互排斥力,从而防止乳滴相互聚集,提高其稳定性。
本研究考察了硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液的冻融稳定性,经过冷冻的乳剂颜色变黄,融化后颜色恢复,未出现破乳、出油或絮凝的现象。冻融后乳剂粒径变大,但仍在静脉注射乳剂的安全范围内,而且随着冻融次数的增加,粒径基本不再变大,粒度分布也不再变宽。说明冻融次数对其粒径并无显著影响,表明此制剂能经受剧烈的环境温度变化,在一定程度上反映了此处方工艺制备的硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液具有良好的稳定性。
本研究考察了硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液在(6±2),(25±2) 和(40±2)℃条件下放置6个月的稳定性,结果表明该制剂在(6±2) 和(25±2)℃条件下均稳定。这提示,硫酸氢氯吡格雷亚微乳注射液的储存温度不宜太高,建议在(6±2)℃储存。
来源:《中国新药杂志》2012年第21卷第15期复方缬沙坦/苯磺酸氨氯地平片的制备和体外溶出测定 作者:靳静,操锋,平其能,张灿