【关键词】
男性因素不育目前的评价手段主要是精液常规分析,而大约15%的男性因素不育患者有一个正常的精液分析,故不能对男性生育能力和辅助生殖的预后进行准确评价。精子DNA的完整性对于精确传递遗传物质至关重要,精子DNA损伤作为一种新的精子功能评价指标受到越来越多的关注,本文对其近年来研究进展进行综述如下。
1 精子DNA损伤病因及发病机制
1.1 病因 与男性不育本身一样,精子DNA损伤也是多因素共同作用的结果,与化疗、放疗、吸烟、生殖道感染、睾丸温度升高、精索静脉曲张、激素、环境污染等因素有关。Toro等研究表明,辅助生殖技术(ART)对精液进行体外处理,室温培养和深低温保藏操作均会加重精子DNA损伤。患β-地中海贫血的男性其精子DNA损伤程度会增加。某些药物,如合成除虫菊酯杀虫剂与治疗抑郁症的药物选择性5-羟色胺重摄取抑制剂也会造成精子DNA损伤。
1.2 损伤机制 精子DNA碎片化的发生机制尚不完全清楚,一般认为与精子发生过程中的异常染色质包装、氧化应激或凋亡异常有关,也可能是几种机制共同作用的结果。
2 精子DNA损伤检测方法
目前国内外尚缺乏规范统一的检测方法和标准,常用的精子DNA检测方法有精子染色质结构分析试验(sperm ehromatin structure assay,SCSA)、彗星试验(COMET assay)、末端转移酶介导的dUTP末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)、染色质扩散试验(spermchromatin dispersion test,SCD)。
2.1 SCSA SCSA由Evenson等于1980年首次提出,是目前检测精子DNA损伤最常用的方法之一,其基本原理是:精子进人附睾后,鱼精蛋白中大量的巯基不断被氧化成二硫键,与DNA更紧密地结合,使DNA更具抗酸能力,维持了双链结构的稳定性。而DNA损伤的精子,鱼精蛋白中多数巯基未被氧化,形成松散结构染色质,在酸的作用下易变性为单链DNA。根据这一原理,用酸处理精液样品,再行吖啶橙(AO)染色,可对精子染色质结构进行检测,然后通过配有专用软件的流式细胞仪可进行数据处理得出SCSA参数。
2.2 彗星试验 彗星试验(comet assay)又称单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE),是在精子细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法。基本原理是:当精子细胞DNA出现断裂时,DNA超螺旋结构变得松散,同时由于暴露了负电荷,损伤的DNA片段在电磁场作用下从核内迁出,向阳极迁移而形成“彗星”样脱尾,然后在荧光显微镜或光学显微镜下或在照片上测出彗星细胞的一些长度数值,如尾长和彗星细胞总长、尾长与头部直径比值等,用以评估DNA损伤程度。
2.3 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法) 是一种分子生物学与免疫组织化学相结合的原位检测凋亡细胞DNA片段的方法,近来常用于评估精子细胞凋亡的情况,TUNEL法优先标记发生凋亡的细胞而不是坏死的细胞,近年得到广泛应用。
2.4 精子染色质扩散试验 精子染色质扩散试验(SCD)是由Fernandez等首先于2003年提出的一种检测精子DNA损伤的新方法,基本原理是正常精子经过一个酸处理去除核蛋白后,精子染色质结构松散,DNA环附于残留的核结构,形成光晕。精子染色质损伤处产生单链DNA片断,从而抑制了DNA光晕的扩散。检测方法:将精子悬液与琼脂糖混合铺于载玻片上,酸处理后溶解细胞去除核蛋白,用DAPI或Diff-Quik试剂染色,最后用荧光显微镜观察。结果根据精子DNA产生的光晕进行评估。
一个理想的检测DNA完整陛的方法必须具备以下优点:
(1)适合自动化操作,简便、迅速;
(2)分析费用低,不需要特殊仪器和试剂;
(3)结果可靠,有利于实验室的标准化。SCSA参数是独立于常规精液参数以外的特殊检验参数,反映了不同精子染色质构象结构的异质性,该方法快速、简便,已经成为染色质完整性检测的“金标准”。Comet试验可检测精子单双链的断裂损伤、抗氧化损伤、遗传毒理学等研究,所需样品和细胞数量少,且灵敏度较高。TUNEL法可检测凋亡精子,因其灵敏可靠被广泛用于细胞凋亡的研究。但是Comet和TUNEL试验有待于建立标准化方法,尚难用于临床精子常规检测。SCD试验与Comet和TUNEL试验相比,结果不仅取决于荧光强度和颜色,还很容易肉眼观察到核的扩散状况,易于较精确地统计。该法简单、快捷、廉价、实用性强。Chohan等的研究结果表明,SCSA,TUNEL,SCD在检测精子DNA断裂方面结果相当,因此SCD法有望成为一个可广泛推广的检测精子DNA损伤的手段。
3 精子DNA损伤与生殖结局的关系
3.1 精子DNA损伤与男性不育 Derick等的研究结果表明不育症男性较正常生育力男性有更高的精子DNA断裂率,畸精症病人异常形态精子率与DNA断裂指数(DNA fracture index,DFI)呈显著正相关。Erenpreiss等根据精液参数正常与异常将不育夫妇分为两组进行精子DNA损伤检测,DFI>20%自然妊娠率明显下降;精液参数正常与异常组DFI有明显差异,而且提示常规精液参数正常的不育男性仍有较高的精子DNA断裂率。
3.2 精子DNA损伤与传统精液分析参数的关系 Cohen-Bacrie等对1633例不育症男性的精液进行WHO标准精液参数分析及运用TUNEL法检测精子DNA损伤率,其中1/3的患者TUNEL率>30%,21项精液参数中有7项与TUNEL率相关,认为精子DNA损伤与精液参数并没有明确的相关性,但是可以作为一种补充的检测手段,从而不难理解ART失败有可能与父系精子DNA损伤有关。Moskovtsev等的研究结果表明,精子DNA损伤与精液密度、活率、正常形态率呈显著负相关。在精子形态学的指标中,精子形态异常与DNA断裂有关,尤其精子头异常与DNA损伤有显著相关性。
3.3 精子DNA损伤与体外受精结局 Muriel等对85例需体外受精-胚胎移植(IVF-ET)、卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)助孕的不孕症患者,采用SCD法检测精子DNA损伤,探讨精子DNA损伤与ART结局,结果发现ART受精率与DNA断裂水平呈负相关;DNA断裂率越高,受精卵原核核仁前体发育不同步性也随之增高;DNA断裂高水平组胚胎发育速度缓慢并且形态异常的比例高;胚胎植入率与DNA断裂率也呈负相关,但IVF妊娠组与非妊娠组的SCD结果差异无统计学意义(P>0.05),考虑与受精以及植入前的胚胎自然选择过程有关。Velez de
综上所述,精子DNA完整性可能是一个比常规精液分析更好的预测男性生育力的指标,继续深入对精子DNA损伤的研究,建立标准化的方法以及制定相应的检测标准值,将对男性不育的病因学及治疗方法产生深远的理论意义和临床实用价值。
(江莉,李娜,李慕军,男性不育症精子DNA损伤研究进展[J]广西医学2011年12月第33卷第12期:1635-1637)