帕金森病(Parkinson’s disease,PD)又称为震颤麻痹,是一种与年龄相关的常见神经系统退行性疾病,由环境和遗传因素引起,65岁以上人群患病率为1%~2%。帕金森病临床表现主要为局限于身体一侧的肢体静止性震颤,伴随症状包括运动迟缓、肌强直及姿势步态不稳。大部分帕金森病的诊断特征者为散发性,仅不足10%的患者呈家族性。帕金森病的诊断特征性标志物是存货的多巴胺神经元中出现嗜酸性蛋白质包涵体,又称路易小体。目前已发现18个基因位点和11个治病基因与帕金森病有关,但这些基因如何参与帕金森病发病尚不完全清楚。阐明这些基因突变所导致的神经系统退行性便的机制,将对延缓帕金森病发病和治疗起着重要的作用。帕金森病症状的出现是由于大脑黑质纹状体致密部多巴胺能神经元(dopaminergic neuron,DN)不断丢失,导致多巴胺含量的显著下降。当病变累及脑内其他区域时,很大一部分患者出现痴呆和幻觉,,有研究表明microRNA(miRNA)与DN分化及生存可能相关。新近研究显示,miRNA广泛参与疾病的发生过程,对基因表达转录后调节和神经细胞表型调控起重要作用,目前已发现数个miRNA的分布和功能与帕金森病存在相关性,且部分已在帕金森病动物模型中得到证实。我们miRNA与帕金森病研究新近展作一概述。
一、miRNA来源及功能
miRNA是一簇微小的内源性非编码单链RNA调节分子,长度约20~22个核苷酸,由内源性基因编码,但不转录成蛋白质。然而,miRNA介导的编码基因转录后调节是通过与靶信使RNA(mRNA)分子的3’非编码区(3’untranslated region,3’UTR)结合,根据序列的互补程度,导致靶mRNA转录抑制或降解,最终引起蛋白质合成降低。然而最近研究也显示miRNA具有上调靶基因的功能。
Lee等首先发现miRNA具有下调线虫基因表达的功能。随后研究发现miRNA广泛存在于生物界中,包括病毒、植物、蝇类、虫类、鱼类、鸟类、啮齿类动物及灵长类动物。miRNA的生物合成涉及多个步骤且需要特定的细胞机制。miRNA合成首先开始于细胞核中,主要在RNA聚合酶Ⅱ(另一部分是RNA聚合酶Ⅲ)的作用下,其基因转录形成初始miRNA。初始miRNA在细胞核中被核糖酸内切酶Ⅲ Drosha和RNA结合蛋白DiGeorge关键区域8(Di Georgecritical region 8)剪切生成约70个核苷酸长度的发夹状前体miRNA。在核糖核酸内切酶Ⅲ Drosha和反式激活应答原件RNA结合蛋白(transactivating response RNA-binding protein)的作用下,运输到细胞质中的前体miRNA被剪切为约22个核苷酸长度的成熟双链RNA分子该双链RNA开始是稳定的,随后解离成2条单链分子,其中1条链被降解,而另1条链与RNA诱导沉默复合物(RNA-induced cilencing complex)结合。RISC通过与靶mRNA的3’UTR的结合,实现靶mRNA与成熟miRNA的不完全互补,致使靶mRNA降解或者转录抑制,最终导致蛋白质表达降低。虽然3’UTR区是miRNA最常见的作用位点,但蛋白质编码区也可存在miRNA的作用位点。
通常每个miRNA可以作用于上百个基因的靶位点,每个miRNA有调节众多靶mRNA的潜能。如果1个miRNA表达异常(高于或低于正常水平),大量基因表达将受到干扰。miRNA表达也受多种因素的调节,非生理情况下,细胞中某个miRNA的转录谱可发生显著改变。在哺乳动物中miRNA可控制30%~50%蛋白编码基因的活性,miRNA在细胞发育、分化、增殖、代谢和凋亡中发挥重要作用。总之,miRNA网络是重要的调节机制,能更好地协调基因表达的调控。
二、帕金森病与miRNA
目前已经发现多个miRNA的人类和黑猩猩的脑组织中表达,高通量序列分析显示至少有1000个miRNA在人类大脑中表达。miRNA表达在大脑发育过程中并非恒定的,一些miRNA在哺乳类动物大脑早期发育中含量相对较高,而另外一些则在哺乳类动物大脑早期发育中含量相对较高。尽管目前仅少量脑特异性表达的miRNA其特定功能被鉴定,但研究表明miRNA在大脑的发育和功能中发挥重要作用,参与调节神经干细胞的分化、神经突的生长及突触的形成。
帕金森病患者中脑黑质纹状体DN的丢失,导致纹状体释放多巴胺不足及基底节对大脑运动皮质刺激减少研究显示miRNA与DN的分化可能有关,特异性剔除Dicer阻碍miRNA的合成,导致胚胎干细胞分化成中脑DN的能力降低。胚胎鼠中脑分离出的小RNA(包括miRNA)转染特异性剔除Dicer的小鼠,改剔除Dicer小鼠中脑DN可部分出现分化,提示miRNA与DN分化及生存可能相关,但尚不清楚miRNA与人类帕金森病的发生是否有关。此外,特异性剔除小鼠中脑DN的Dicer,导致DN凋亡增加及神经退行性病变,中脑的DN进行性丢失,甚至黑质纹状体中DN丢失可高达90%,动物表现出运动能力降低类似帕金森病患者的运动障碍。这些研究提供了miRNA可能参与P帕金森病的发生及发展的证据。目前,主要发现以下几种miRNA可能与帕金森病相关。
2003年Dostie等发现miR-175基因定位于人类X染色体上,而该定位区域是早发型帕金森综合征的候选区域,故miR-175可能涉及帕金森病的发病。
2007年Kim等法中中脑DN特异性表达miR-133b,丢失DN的帕金森病患者中脑组织缺乏miR-133b的表达。Mir-133b通过调节同源结构转录因子3(Pitx3)的表达来调控中脑DN的成熟及功能。Pitx3特异性诱导miR-133b的转录,而miR-133b的又反过来抑制Pitx3的活性。体外实验发现,miR-133b的耗竭增加DN标志物的表达和去极化诱导的多巴胺释放,而miR-133b过度表达抑制DN神经元充分分化并导致多巴胺释放显著减少。尽管miR-133b在帕金森病患者中表达减少,但miR-133b并不是胚胎干细胞Dicer表型及小鼠Dicer突变体进行性丢失DN的主要因素,帕金森病可能源于Pitx3依赖基因逼到的缺失而非miR-133b。因此,miRNA对DN退行性病变的保护作用有待进一步证实。2010年de Mena等发现西班牙白人miR-133b(包括miR-133b)和Pitx3的DNA变异鱼帕金森病发生无显著相关性,尽管这些基因的变异和(或)多态可能涉及DN的存活。
2008年Wang等发现美国白人miR-433在单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP)rs12720208处抑制成纤维细胞生长因子20(FGF20)的转录。FGF20主要在黑质纹状体中表达并且有促进DN生存的功能,SNP rs12720208位于FGF20基因的3’UTR区,是miR-433的结合位点。SNP rs12720208与帕金森病发生的危险性相关,rs12720208风险等位基因阻碍miR-433的结合位点,使FGF20的转录增加。细胞培养使用及帕金森病患者的脑组织中,FGF20的转录增加导致α-突触核蛋白(SNCA)的过度表达。而SNCA是公认的帕金森病发病的一个关键因素,SNCA的过度表达是帕金森病患者的一个共同特点。帕金森病患者神经细胞中异常聚集的路易小体主要由SNCA组成,路易小体是帕金森病神经病理学的一个贴点切实诊断帕金森病的特征性标志物。因此,miR-433可能与帕金森病的发病相关。但2010年 de Mena等发现西班牙人FGF20 SNP rs12720208与帕金森病发生的危险性无关,miR-433的DNA变异也极少与帕金森病发生的危险性相关,并且在西班牙帕金森病患者中没有发现miR-433的核苷酸变化。故该研究结果又待进一步确认。
2009年Junn等发现miR-7主要在神经细胞中表达,miR-7与SNCA的mRNA 3’UTR结合,抑制SNCA的表达,从而保护细胞对抗SNCA诱导的蛋白酶抑制及毒性。随后的研究显示,在1-甲基-4苯甲-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病模型中,miR-7表达降低可能导致SNCA的增加表达。这些提示miR-7可能通过上调SNCA表达而参与帕金森病的发病。2010年Doxakis发现miR-7和miR-153参与SNCA的转录后调节,与SNCA的mRNA 3’UTR结合下调SNCA的mRNA及蛋白质水平。miR-7、miR-153与SNCA协同表达与神经细胞中,通过转录前馈回路调节SNCA的表达。miR-7和miR-153在中脑和但皮质中高表达,人类年龄和(或)环境因素可能导致miRNA的表达改变,从而增加SNCA的表达水平及帕金森病发病风险。
三、miRNA在帕金森病动物模型中的研究
2007年Kim等研究发现正常小鼠中脑特异性表达miR-133b,类似于人类,在无晶状体小鼠和6-羟多巴(6-OHDA)处理的小鼠中表达降低,无晶状体小鼠下降尤为明显。无晶状体小鼠是自然发生的突变体,其体内缺乏Pitx3基因,而Pitx3是中脑DN发育分化及存活所需的重要同源域转录因子,Pitx3的多态性与人类的帕金森病相关。miR-133b与Pitx3形成一个负反馈环调节DN的发育及功能,然而目前未发现缺乏miR-133b的小鼠突变体,故不能确定miR-133b的缺失与帕金森病的发病存在直接关联。
2009年Junn等发现miR-7主要在小鼠神经细胞中表达,并且能保护SNCA突变(A53T)小鼠,对抗SNCA诱导的蛋白酶抑制及毒性,但需要SNCA野生型3’UTR的参与。随后研究发现在MPTP神经毒素诱导的帕金森病小鼠模型中miR-7表达下降,提供了miR-7通过上调SNCA表达涉及MPTP模型黑质纹状体系统退行性变的证据。
2010年Asikainen等用miRNA微阵列法现在3种帕金森病相关的线虫模型中miRNA基因表达的变化:其中12个特异性miRNA在SNCA突变(A53T)体中、5个囊泡儿茶酚胺转运体突变(cat-1)线虫红、3个在帕金森同源基因(pdr-1)突变线虫中差异表达。在SNCA转基因线虫及cat-1中,miR-64和miR-65表达境地,miR-58过度表达。Let-7家族成员let-7、miR-48和miR-84在SNCA突变体及pdr-1突变体中均表达降低,对这些miRNA的靶位点的分析提示miRNA介导的保护机制与帕金森病的发病相关。
四、展望
帕金森病是一类发病机制赋值的神经退行性疾病,目前尚无置于的有效方法,药物治疗仅仅能减轻症状,难以延缓疾病的进程,一定程度上是由于对帕金森病发生的细胞分子机制了解有限,基因多样性、环境复杂性及大脑自身老化,加大了阐明帕金森病发病机制的艰巨性,但最新证据表明miRNA与帕金森病的发病有关。尽管目前帕金森病领域有关miRNA的研究较少,但深入研究帕金森病患者脑中miRNA的表达改变将有利于阐明miRNA在帕金森病发病中的作用,进而为帕金森病的治疗提供新的基因及药物靶点。(文献:高凯 郑文 邓昊 《帕金森病与microRNA研究》 中华神经科杂志2012年12月第45卷第6期)