【摘要】 目的 检测重症患者外周血中药物特异性T细胞扩增及干扰素γ(IFN-γ)产生情况。 方法 共收集10例重症药疹门患者,分离患者外周血单一核细胞(PBMC),经相应的致敏药物刺激后培养出T细胞株,用体外ELISpot和培养ELISpot方法检测患者PBMC及药物特异性T细胞株分泌IFN-γ的情况。对10例患者同时设立与致敏药物分子结构不同的无关药物对照组。结果 重症药疹组中德10例患者PBMC、药物特异性T细胞株经致敏药物刺激后,IFN-γ的分泌明显高于正常对照组(P<0.01),且T细胞株经药物刺激后IFN-γ的分泌显著高于PBMC组(P<0.01)。与致敏药物分子结构不同的无关对照药物不能够使药疹患者PBMC产生IFN-γ,不能培养出相应的T细胞。3例重症药疹患者治愈1~3年后,PBMC中仍存在药物特异性T细胞。结论 重症药疹患者体内存在药物特异性T细胞。体外ELISpot联合培养ELISpot方法在体外检测可能有助于致敏药物的鉴定。药疹患者治愈后体内持续存在药物特异性T细胞。
【关键词】 药疹;T淋巴细胞;干扰素Ⅱ型
药疹是由药物引起的不良反应,种类繁多,Stevens-Johnson综合征(Stevens-Johnson syndrome,SJS)、大疱性表皮坏死松解型药疹(toxic epidermal ecrolysis ,TEN)是药疹中严重的两种类型,常伴有大面值表皮剥脱,具有较高的死亡率。起病较急,症状较重,常伴有发热、心、肺、肝、肾等内脏损害,甚至导致死亡。在对重症药疹的研究中相继发现,SJS与TEN患者在首次发生药物过敏反应之后,再次接触只敏药物反应迅速、强烈,对患者机体的损伤也更为严重。HLA基因在决定患者是否罹患重症药疹中具有重要作用。HLA-B*1502与卡马西平、HLA-B*1502与别嘌醇导致的重症药疹相关。重症药疹患者皮损、水疱内含有HLA限制性、具有细胞毒活性的CD8﹢T细胞。应用药物及其衍生物,可从患者外周血单一核细胞(PBMC)中培养获得药物特异性T细胞株和T细胞克隆。上述结果证实,免疫学机制在SJS、TEN发病中具有关键作用。大多数发疹型药疹的发病属于Th1反应优势,重症药疹患者外周血T细胞受致敏药物刺激后,Th1释放IFN-γ增加,国内外也均由采用ELISA法、ELISpot方法体外检测IFN-γ来判断药物特异性T细胞。为进一步了解其在重症药疹发病中的作用,我们分离获得了重症药疹患者好转后的PBMC,并采用体外ELISpot和培养ELISpot方法观察药物特异性T细胞。
对象与方法
1.检测对象:重症药疹组10例,为2005年9月至2009年7月在本院皮肤科病房确诊为SJS、TEN的患者、其中SJS6例,女4例,男2例;TEN4例,女2例,男2例;年龄3-80岁,平均年龄36岁,病史1周至3年;可明确致敏药物4例,可疑致敏药物2种5例,3种1例;可疑致敏药物为阿莫西林5例,尼美舒利2例,硫酸羟氯喹2例,另外,头孢唑林钠、地尔硫卓、卡马西平、安乃近、盐酸地尔硫卓,对乙酰氨基酚、青霉素、别嘌醇各1例。正常人对照组10例,均为本实验室工作人员,女6例,男4例。其他类型药疹组10例,男4例,女6例;其中红皮病型3例,多形红斑性2例,紫癜型3例,荨麻疹型2例;可明确致敏药物3例,可疑致敏药物2种7例。其中可疑致敏药物为阿莫西林4例,尼美舒利,硫酸羟氯喹、头孢唑林钠,卡马西平、对乙酰氨基酚各2例,地尔硫卓、安乃近、盐酸地尔硫卓、青霉素、别嘌醇各1例。三组年龄差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
2.致敏药物:根据患者病史,结合SJS和TEN常见致敏药物的类型,初步判断出致敏药物。在应用致敏药物研究的同时,对部分患者设立分子结构不同的无关药物对照组。
3.主要试剂:人淋巴细胞分离液购自天津津脉基因测绘技术有限公司,ELISpot人IFN-γ试剂盒购自瑞典Mabtech公司;ELISpot96孔板购自美国Millipore公司;植物血凝素(PHA)购自美国Sigma公司。
4.血样采集与处理:抽取患者及正常人20ml外周血,肝素抗凝,加入淋巴细胞分离液后梯度离心(20°C,2000 r/min,20 min),分离出PBMC,并用含10%胎牛血清的1640培养液将细胞数调至2×106 。各孔中分别加入可能致敏的药物及无关对照药物,设立不含药物的空白对照组。孵育20h后,行ELISpot IFN-γ检测。
实验中致敏药物的浓度按照患者治疗浓度及此药物的血药浓度来推算,其实验浓度如下:阿莫西林40 mg/L、头孢唑林钠50 mg/L、尼美舒利7 mg/L、硫酸羟氯喹40 mg/L、地尔硫卓150 mg/L、安乃近50 mg/L、别嘌醇50 mg/L、,其中尼美舒利选用尼美舒利分散片,硫酸羟氯喹、地尔硫卓。安乃近、盐酸地尔硫卓均为成分药(购自武汉远城科技发展有限公司),将其溶于1640培养液后钴60灭菌。文献上已知可用的药物浓度有:卡马西平25 mg/L,对乙酰氨基酚50 mg/L。
5.药物特异性T细胞株的培养:用含10%胎牛血清的1640培养液将PBMC调至2×106 ,按每孔加入1.8ml加至24孔板中,在重症药疹组加入200µl相应得致敏药物,空白组加200µl培养液。培养3 d换液时弃掉1 ml含IL-2(200IU/ml)的培养液,7 d 后行ELISpot IFN-γ检测。
6.ELISpot 检测IFN-γ:实验分为重症药疹组、正常人对照组以及其他类型药疹组,分离PBMC、药物特异性T细胞,分别加至ELISpot培养板中,观察致敏药物刺激前后IFN-γ的分泌水平。同时每组内分别设置阴性对照(不加入任何刺激),阳性对照(加入PHA10µl,终浓度4 mg/L)。
7.统计学分析:采用方差分析和SNK-q 检验。P<0.05认为有统计学意义。
结果
1.体外ELISpot:10例重症药疹患者PBMC经致敏药物刺激后IFN-γ的分泌均明显高于对照药物组、正常人对照组及其他类型药疹组(P<0.01),但重症药疹患者加入非致敏药物培养的PBMC,IFN-γ的分泌则于正常人对照组无明显差异。10例其他类型药疹中有4例PBMC经致敏药物刺激后IFN-γ的分泌较对照药物及正常人对照组升高(P<0.05);而正常人PBMC加入与重症药疹患者相同的致敏药物刺激前后的差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。另外IFN-γ的分泌会随着与致敏药物共培养天数的增加而增多。
2.培养ELISpot:使用相应致敏药物培养出药物特异性T细胞株,并做ELISpot观察,发现药物特异性T细胞株经致敏药物刺激后IFN-γ的分泌明显高于正常人对照及其他类型药疹组(P<0.01),而加入非致敏药物培养的药物特异性T细胞株,IFN-γ的分泌则于正常人对照组差异无统计学意义。10例其他类型药疹中有4例T细胞株经致敏药物刺激后IFN-γ的分泌较对照药物组及正常人对照组有所升高(P<0.05);而正常人加入与重症药疹患者相同的致敏药物刺激前后的差异亦无统计学意义(P>0.05,见表1)。SNK-q检验分析结果显示,PBMC、T细胞株两组间IFN-γ的分泌差异有统计学意义(P>0.05),经药物刺激后的T细胞株IFN-γ的分泌水平高于PBMC组。
3.药物特异性T细胞的长期存在:3例病愈后1~3年的重症药疹患者,其PBMC及T细胞中均存在药物特异性T细胞。提示至少在此期间内(3年),患者仍不能应用相关药物,见图1。
表1 药疹患者PBMC及药物特异性T细胞经致敏药物刺激后IFN-γ的分泌情况(
分组 |
例数 |
PBMC |
特异性T细胞 |
正常人 |
10 |
|
|
刺激前 |
|
2.03±4.67 |
2.02±6.16 |
刺激后 |
|
2.40±5.45 |
1.96±6.17 |
其他类型药疹 |
10 |
|
|
加对照药物 |
|
2.13±4.90 |
2.02±5.66 |
加致敏药物 |
|
36.35±3.71 |
82.72±85.58 |
重症药疹 |
10 |
|
|
加对照药物 |
|
2.78±36.31 |
10.10±13.36 |
加致敏药物 |
|
49.54±177.25 |
94.31±327.37 |
注:表中数据为患者PBMC、特异性T细胞经致敏药物刺激后产生IFN-γ的细胞数(IFN-γ的数量/2×106 ,单位:个)。重症药疹患者两组间及与正常人组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);其他类型药疹致敏药物组与对照药物组差异有统计学意义(P<0.05)
讨论
我们应用体外ELISpot方法,观察重症药疹患者外周血药物特异性T细胞存在的情况。在所筛查的10例中,其外周血均存在相应的药物特异性T细胞,并在相关药物的刺激下残生IFN-γ。并且,在相关药物及IL-2存在的条件下,相应的T细胞可以得到选择性扩增,能够很好地培养获得药物特异性T细胞株,其产生IFN-γ的细胞明显增加。我们的研究支持药物特异性T细胞的活化和存在,可能是重症药疹发病的重要机制之一。在10例非重症药疹患者中的4例,我们同样培养出可产生IFN-γ的药物特异性T细胞株,这说明在有些非重症药疹患者体内,药物特异性T细胞也可作为导致其发病的机制之一,或是说它有可能会进一步发展为重症药疹,这一结论与既往相关文献报道一致,关于其作用机制我们将在以后的工作中进一步探索。
为了进一步了解该方法在检测致敏药物方面的可行性,在详细追问患者用药史,确认致敏药物的同时,我们对10例重症药疹患者的PBMC加入分子结构不同的无关药物,同时应用体外ELISpot和培养ELISpot方法,观察患者PBMC对无关药物的反应情况。结果证实,无关药物不能够使患者PBMC产生IFN-γ,也不能够扩增患者的T细胞。本方法经反复试验证实具有较高的稳定性,提示,体外ELISpot联合培养ELISpot方法对体外检测患者的致敏药物具有潜在的应用价值。
在对长时间痊愈后的3例重症药疹患者的研究发现,药物特异性T细胞能够长时间存在于患者体内。通过对药物刺激,其T细胞能够得到选择性扩增,并分泌IFN-γ。提示对于重症药疹患者,再次接触致敏药物仍有可能导致相应疾病的出现。因此,长时间的严格避免致敏药物是必要的。我们的研究提示,从药物特异性T细胞角度进一步研究其在重症药疹发病中德作用,观察临床治疗用药对药物特异性T细胞的调控和干预作用,对深入揭示重症药疹发病机制和临床药物的治疗机制具有重要意义。
参考文献: 高扬,付萌,史晓蔚,廖文俊,高琳,高天文,王刚,李承新,刘玉峰, 重症药疹患者外周血药物特异性T细胞扩增及干扰素γ产生的研究,中华皮肤科杂志2010年7月第43卷第7期