许多心血管疾病都与一氧化氮(Nitric Oxide,NO)活性低下或生成不足有关,如动脉粥样硬化、
高血压病、心肌缺血再灌注、心力衰竭等。已有动物研究表明 [1,2] ,四氢生物蝶呤作为一氧化氮合酶的重要辅助因子,参与NO的合成。外源性补充可减少各种氧自由基的产生,降低脂质过氧化的水平,从而延缓并减少
心脑血管疾病的发生及进展。但BH 4 的价格昂贵,使其临床应用受到限制。研究已明确叶酸与四氢生物生物蝶呤系类似物 [3] ,本研究旨在观察FH 4 是否可以提高实验性高胆固醇血症兔组织内的BH 4 含量,以探讨FH4的作用机制及价廉的BH 4 取代FH 4 的可行性。本实验采用常用的尿液蝶呤分析来检测BH 4 含量。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 选取纯种新西兰大白兔(青岛市动物实验中心提供,体质量2.0~2.25kg,雄雌不限)24只,随机分成4组(n=6)。在适应性喂养1周后,进入实验阶段。A组进食普通饲料,其余各组进食高脂饲料。B组为模型组,C组为BH 4 干预组,D组为叶酸干预组。高脂饲料的配方为:1%胆固醇,8%猪油,75%蛋黄粉,83.5%普通颗粒饲料。限食量,每兔每日250g,分笼喂养,共喂养60d。每半月测体重一次。C组同时给予BH 4 2mg/(kg·d),溶解在食用水中,与水同饮;D组同时给予叶酸2mg/(kg·d),溶解在食用水中,与水同饮。
1.2 标本采集及处理 所有实验动物喂养60d后,取耳缘静脉血2ml,室温下放置15min,4000r/min离心15min,取血清,分装编号。测定血清总胆固醇(TC)含量。同时,抽取膀胱尿液5ml,马上加入维生素C(20mg/ml urine),避光下混合均匀后分装于避光容器中,冷冻在-80℃待分析。
1.3 统计学方法 实验数据经SPSS11.0统计软件处理,P<0.05差异有统计学意义;P<0.01差异有显着统计学意义。
2 结果
2.1 各组血清TC含量测定结果 见表1。
表1 各组血清TC含量 (略)
注:与A组比较, △ P<0.01
表1说明,与正常饮食组相比较,其它各组的胆固醇明显升高,差异有非常显着性(P<0.01),BH 4 组与FH 4 组的胆固醇虽低于模型组,但差异无显着性。高胆固醇血症兔的模型已建立成功。
2.2 各组尿样中生物蝶呤测定结果 见表2。
表2 各组样品中尿蝶呤含量 (略)
注:与B组比较, △ P<0.05
表2说明,模型组与其它各组比较,新蝶呤升高而生物蝶呤下降,差异有显着性,P<0.05。
3 讨论
近年来,一氧化氮(Nitric Oxide,NO)及一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的关系及其生理功能受到了人们的广泛关注。由NOS合成的NO具有多种生理和病理作用,可使血管平滑肌舒张,抑制白细胞粘附于内皮细胞上,抑制血小板与血管壁间的相互作用,以及抑制血管平滑肌细胞的增生和损伤。
实验表明 [4] 细胞内BH 4 水平决定了结构型一氧化 氮合酶(constitutive NOS,cNOS)是产生NO或超氧化物,并调节着二者的平衡。此外,BH 4 还可降低次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶产生超氧化物的能力,具有直接的抗氧化作用,减少组织、细胞的氧化损伤。因此,BH 4 在维持正常血管反应过程中具有重要的生理学意义。
高脂造成BH 4 含量绝对或相对减低可能的原因是:(1)脂质过氧化物及氧自由基生成增多造成细胞内氧化应激状态 [5] ,而BH 4 在细胞内的合成有赖于正常的氧化还原环境;(2)NOS活性上调,导致BH 4 活性相对降低。
叶酸与BH 4 为类似物,两者结构相似,参与的递氢、递甲基反应相似,催化的酶亦相同 [3] 。Hyndˉman ME [6] 等证实叶酸与BH 4 的作用靶位相似,它可直接作用于NOS提升NO的产量和促进内皮功能。另外,叶酸尚可提高BH 4 的生物利用度,刺激内源性BH 4 的再生 [7] 。叶酸在细胞内很易被还原为甲基四氢叶酸,后者是前者在循环系统的主要活性形式,甲基四氢叶酸是同型半胱氨酸(Hcy)降解途径中重新合成蛋氨酸的甲基供体,由此可降低Hcy的浓度。叶酸缺乏导致代谢通路受阻,血中Hcy累积,成为高Hcy血症。研究发现,Hcy可在金属离子介导下,自身氧化生成过氧化物及氧自由基,损伤内皮细胞的结构和功能,降低了内皮依赖性舒张因子-NO的生物活性 [8,9] ,并提高了血液凝固性,从而启动了粥样硬化斑块形成。有报道 [6]证明足量的叶酸可优化NOS的活力、防止硝酸酯类药物的耐受。从而保护血管内皮,延缓心脑血管疾病的进展。
BH 4 缺乏症最常见是由于BH 4 合成代谢途径中的合成酶6-丙酮酰四氢蝶呤(PTPS)缺乏所致 [10] ,也可因二氢生物蝶呤还原酶(DHPR)活性降低所致,DHPR活性降低的病人体内往往积聚大量的FH 2 ,Smith I等 [11] 报道用大剂量的叶酸可促进FH 2 向FH 4 转化,从而提高细胞内的FH 4 水平。当因PTPS缺乏导致下降时,尿新蝶呤(neopterin,N)明显增加,生物蝶呤(biopterin,B)明显降低,N/B增高。尿蝶呤分析是评定BH 4 的有效的诊断方法,随着蝶呤检测技术的发展,目前,国外越来越倾向直接检测血浆中生物蝶呤、尿蝶呤及BH 4 的浓度,该检测对设备及技术要求较高 [12] 。本实验的统计数字表明:高脂饮食导致生物蝶呤明显降低,而新蝶呤则明显升高,与正常饮食组相比较,有显着的统计学差异。但在叶酸及BH 4 的干预下,生物蝶呤及新蝶呤均可恢复,两组间无统计学差异。说明叶酸与BH 4 相似,均可提高细胞的BH 4 含量。
目前,叶酸改善内皮功能的机制目前倾向于以下几种观点 [11,13] :(1)增加BH 4 从醌型BH 2 再生,对于BH 2 积聚的患者,用叶酸的代谢进行干预,可提高BH 4 的水平;(2)可能作为NO合成的电子供体或蝶呤还原酶;(3)减少同型半胱氨酸的产生;(4)加强BH 4 与eNOS结合;(5)提高BH 4 的生物利用度;(6)直接的抗自由基作用。本实验表明,FH 4 与BH 4 均无明显降低血清总胆固醇的作用,说明FH 4 与BH 4 对内皮细胞的保护作用并不依赖于降低血脂。叶酸干预组同BH 4 干预组相似,均可明显升高尿蝶呤,与模型组比较有统计学差异(P<0.05)。该实验结果支持上述观点,提示外源性补充叶酸可提高高胆固醇血症兔组织内BH 4 的水平,从而保护血管内皮功能减少心血管事件的发生。为心血管疾病的防治寻求新的适合我国国情的治疗途径。国外对此研究已在临床开展,而国内的研究尚需加强。(参考来源:四氢生物蝶呤与叶酸对高脂血症兔尿蝶呤的影响,陆伟,中华现代内科学杂志2005年第2卷第1期)