【摘要】目的 探讨乙型肝炎病毒C区/BCP区变异与乙型肝炎相关性慢加急性肝衰竭(ACLF)的关系。
方法 收集44例ACLF患者和28例
慢性乙型肝炎患者(CHB)的血清及临床资料,并对其中10例ACLF患者进行随访,每周收集血清1次。依据MELD评分对患者的病情进行判断。采用巢氏PCR方法扩增HBV DNA,扩增产物直接测序。序列比对采用BioEdit(7.0.9.0)生物分析软件。采用荧光定量PCR法检测HBV DNA含量。数据采用SPSS 13.0软件分析,两组间比较采用t检验及t''检验。
结果 44例ACLF患者基因型均为C型,28例CHB患者中仅两例基因型为B型,其余均为C型。ACLF组患者A1762T、G1764A、T1753V、G1896A、G1899A变异频率分别为88.6%(39/44)、93.2%(41/44)、61.4%(27/44)、63.6%(28/44)和29.5%(13/44),CHB组分别为64.3%(18/28)、67.9%(19/28)、14.3%(4/28)、21.4%(6/28)和3.6%(1/28),两组比较,χ2值分别为6.152、7.901、15.468、12.331和7.370,P值均<0.05,差异均有统计学意义。ACLF组内MELD评分<20、20~25、>25组间差异均无统计学意义。CHB组前C区、BCP区均未发生变异的频率为17.9%(5/28),ACLF组为2.3%(1/44),CHB组前C区、BCP区均未发生变异的频率高于ACLF组,χ2=5.440,P=0.020,差异有统计学意义。ACLF组前C区、BCP区同时发生变异的频率为79.6%(35/44),CHB组为39.3%(11/28),两组比较,χ2=12.021,P<0.01,差异有统计学意义。CHB组仅BCP区有变异的发生频率为42.9%(12/28),ACLF组为20.5%(9/44),χ2=4.157,P=0.041,差异有统计学意义。两组均未出现单独的前C区变异。10例ACLF患者均出现3个或3个以上的联合变异位点。G1896A、T1753C、A1846T变异随着病情好转而恢复。
结论 乙型肝炎病毒前C区/BCP区变异可能与ACLF的发生相关。
在慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)所有病因中,HBV因素占90.29%。乙型肝炎重症化的发生机制十分复杂,HBV基因变异导致的病毒生物学特性改变是重要因素之一。我们通过对乙型肝炎相关性ACLF和慢性乙型肝炎(CHB)患者前C区/基本核心启动子(base core promoter,BCP)区变异位点的比较,同时对ACLF患者进行随访,探讨ACLF与乙型肝炎病毒前C区/BCP区变异的关系。
资料与方法
1.研究对象:收集2007年5月-2011年月就诊于天津市第三中心医院的44例乙型肝炎相关性ACLF患者和28例CHB患者血清及临床资料,并对ACLF组中10例患者进行随访。收集各组患者空腹静脉血,于4℃,3000 r/min,离心15 min,留取血清待检。10例随访患者每周收集血清1次。诊断依据分别符合《肝衰竭指南》和《慢性乙型肝炎防治指南》。入选病例及随访期间HBV DNA均为阳性,随访时间为2周~2月。入选病例均排除肝脏
肿瘤(包括原发性、继发性)及其他原因引起的肝衰竭,同时排除合并其他感染的患者。
2.HBV DNA的定量:采用ABI 7000型荧光定量PCR仪,购自美国ABI公司,HBV DNA荧光定量检测试剂盒,购自上海科华公司,进行HBV DNA定量,检测下限为500 拷贝/ml,本组资料中将HBV DNA定量低于检测下限的定为阴性。
3.巢式PCR扩增:用HBV DNA荧光定量检测试剂盒处理的血清样品进行巢式PCR扩增,扩增区域为前C区、BCP区、S区。引物均由上海英潍捷基贸易有限公司合成。S区1次PCR上游引物为5''-GGGCAGCAAAGCCAAAAGACCAC-3'',下游引物为5''-GAGTCTAGACTCGTGGTGGAC-3'',2次PCR上游引物为5''-GAGTCTAGACTCGTGGTGGAC-3'',下游引物为5-GTCTCTGACATACTTTCCAATCAATAGG-3''。前C区、BCP区上游引物1为5''-ATGTCAACGACCGACCTTGAGGC-3'',下游引物2为5-TTCCCGAGATTGAGATCTTCTGCG-3'',下游引物3为5''-TTCCCGAGATTGAGATCTTCTGCG-3''。PCR反应体系包括:12.5 μl AmpliTaq Gold 360 Master Mix(购自美国应用生物系统公司)、上下游引物各0.5 μl、模板2 μl,加超纯水至25 μl。反应条件:94℃ 2 min,60℃ 45 s,72℃ 45 s,35个循环,72℃ 5 min。2次PCR反应同前,模板为1次PCR产物。
4.测序:将PCR产物送上海英俊生物技术有限公司测序,基因型通过BioEdit(7.0.9.0)生物分析软件对比基因库中公布的标准C、B、A、D、E、F基因型序列,然后进行树图分析获得;选用基因库中公布的标准基因型相关序列与测序结果进行比对分析。
5.患者病情的判断:依据MELD评分对患者的病情进行判断。MELD计算公式:MELD分值=3.8×In[胆红素(mg/dl)]+11.2×ln(凝血酶原时间国际标准化比值)+9.6×In[肌酐(mg/dl)]+6.4×1。
6.统计学方法:数据采用SPSS 13.0软件分析,计量资料数据以(x(-)±s)表示,两组间比较采用t检验及t''检验。组间变异情况采用χ2检验,Fisher’s Exact Test分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.患者基本情况:ACLF组患者44例,男性31例,女性13例,平均年龄(51.6±10.9)岁,CHB患者28例,男性20例,女性8例,平均年龄(38.7±10.5)岁,两组患者年龄比较,t=4.438,P=0.000,差异有统计学意义;两组患者男女比例差异无统计学意义。10例随访ACLF患者,男性8例,女性2例,平均年龄(52.7±11.4)岁。
2.基因型:根据测得的S区基因序列判断HBV基因型,ACLF组患者基因型均为C型,CHB组患者2例为B型,其余均为C型,两组比较,差异无统计学意义。
3.ACLF组和CHB组C区/BCP区变异的比较:ACLF组患者A1762T、G1764A、T1753V、G1896A、G1899A变异频率分别为88.6%(39/44)、93.2%(41/44)、61.4%(27/44)、63.6%(28/44)和29.5%(13/44),CHB组分别为64.3%(18/28)、67.9%(19/28)、14.3%(4/28)、21.4%(6/28)和3.6%(1/28),两组比较,χ2值分别为6.152、7.901、15.468、12.331和7.370,P值均<0.05,差异均有统计学意义。ACLF组A1846T、C1766T、T1768A、T1853C变异频率分别为31.8%(14/44)、6.8%(3/44)、6.8%(3/44)和6.8%(3/44),CHB组分别为25%(7/28)、0、0和0,两组比较,χ2值分别为0.385、1.992、1.992、1.992,P值均>0.05,差异无统计学意义。
4.ACLF和CHB患者前C区/BCP区联合变异分析:A1762T+G1764A、G1896A+G1899A、T1753V+A1762T+G1764A、G1896A+G1899A+A1762T+G1764A、A1762T+G1764A+G1896A联合变异频率在ACLF组分别为88.6%(39/44)、27.3%(12/44)、38.6%(17/44)、25%(11/44)和58.6%(25/44),CHB组分别为64.3%(18/28)、0、14.3%(4/28)、0和17.9%(5/28),两组比较,χ2值分别为6.152、9.164、4.911、8.262、10.686,P值均<0.05,差异有统计学意义,T1753V+A1762T+G1764A+G1896A+G1899A联合变异频率ACLF组为11.4%(5/44)、CHB组为0,两组比较,χ2=3.419,P=0.064,差异无统计学意义。
5.ACLF和CHB患者变异情况的比较:将HBV的变异情况分为四种,分别是前C区、BCP区均无变异,仅BCP区变异,仅前C区变异和双区变异。双区均有变异的频率ACLF组为79.6%(35/44),CHB组为39.3%(11/28),两组比较,χ2=12.021,P<0.01,差异有统计学意义。仅BCP区有变异的频率CHB组为42.9%(12/28),ACLF组为20.5%(9/44),两组比较,χ2=4.157,P<0.05,差异有统计学意义。前C区、BCP区无变异的频率CHB组为17.9%(5/28)、ACLF组为2.3%(1/44),CHB组高于ACLF组,χ2=5.440,P<0.05,差异有统计学意义。两组患者均未出现单独的前C区变异。
6.ACLF组不同MELD评分患者变异情况的比较:根据 MELD评分将44例患者分为<20、20~25、>25三组,分别比较了A1762T、G1764A、T1753V、G1896A、G1899A、A1864T及A1762T+G1764A、G1896A+G1899A、T1753V+A1762T+G1764A、G1896A+G1899A+A1762T+G1764A、A1762T+G1764A+G1896A、T1753V+G1896A+G1899A+A1762T+G1764A联合变异的变异频率,各组间差异无统计学意义。
7.10例ACLF患者随访期间HBV变异位点和MELD评分的变化情况:10个患者入选时均存在3个或3个以上的联合变异位点。患者1、3随访期间MELD评分下降,变异位点无变化,联合变异始终存在,患者2、5随访中MELD评分逐渐升高,联合变异持续存在。患者4随访期间MELD评分有所下降,伴随着G1899C的消失。患者6入选时即存在A1762T+G1764A+A1846T+G1896A联合变异,随访期间MELD评分显著下降,随访第1周G1896A变异恢复。患者7入选时存在在A1762T+G1764A+A1846T+G1896A联合变异,随访第1周MELD评分升高,变异位点没有变化,随访第2周MELD评分下降,A1846T变异消失。患者8入选时存在在A1762T+G1764A+A1846T+G1896A联合变异,随访期间MELD评分呈下降趋势,于随访第1周A1846T变异消失,T1753C变异出现,随访第2周G1896A变异消失,随访第3周T1753C变异亦消失,患者9治疗前存在T1753C+A1762T+G1764A联合变异,治疗后病情好转,MELD评分下降,T1753C变异消失,随访第4周MELD评分由13.512升高到15.121,同时伴随T1753C变异的出现,随访至第9周时,MELD评分降至12.112,上述变异位点均消失。患者10于随访初期出现了1896、1899、1846位点变异,随病情恢复,MELD评分下降,上述变异位点均消失,但A1762T+G1764A双变异持续存在。
讨论
慢性HBV感染的结果取决于病毒、肝细胞及宿主免疫反应之间的关系。当出现特殊的HBV变异打破三者的平衡,就会改变病毒与肝细胞之间的关系,引起肝细胞炎症,导致爆发性或严重的肝炎发生。目前,乙型肝炎重症化的机制尚不清楚,国内外文献对HBV变异与乙型肝炎重症化的相关性存在较大争议。本实验通过对乙型肝炎相关性ACLF和CHB前C区/BCP区变异位点的比较,并同时对ACLF患者进行随访,以期了解乙型肝炎病毒变异与乙型肝炎相关性ACLF发生和发展之间的关系。
本研究结果显示,ACLF组A1762T、G1764A、A1762T+G1764A变异频率高于CHB组,且两组间的差异有统计学意义,与Li等的研究结果类似。对ACLF患者的随访结果表明,A1762T、G1764A、A1762T+G1764A变异出现的频率高,恢复慢,可能是ACLF患者病情迁延的原因。BCP区双突变可使作为免疫耐受因子的HBeAg滴度下降,增强细胞毒T淋巴细胞对细胞膜上HBcAg的攻击,激发或加重机体的免疫反应,导致HBV感染的肝细胞损伤,造成病情加重,是重型肝炎可能的发病机制之一。阎涛等的研究结果有所不同,其通过比较HBV慢性感染后处于疾病不同阶段患者的A1762T+G1764A变异发生率发现,A1762T+G1764A的变异与HBV感染后疾病进展相关,但不具备ACLF特异性。可能是由于研究的病例数及ACLF的基础
肝病情况不同造成与本研究结果的不一致。
研究表明,BCP区和前C区的T1753V(C/A/G),C1766T和T1768A的变异能提高病毒复制能力,降低HBeAg的表达,并且在临床中与某些病例的急性肝衰竭相关。我们比较了T1753V、T1753V+A1762T+G1764A变异发生率在ACLF组和CHB组中的差异,发现ACLF组高于CHB组,差异有统计学意义。Jammeh等的研究结果表明,T1753V+A1762T+G1764A联合变异与急性肝衰竭和终末期肝病相关,可能是T1753V变异导致HBeAg合成减少,肝细胞内HBcAg、DNA聚合酶及HBV DNA水平增加引起的。Ren等认为T1753V变异的出现可能是促进ACLF病情发展的因素。本组资料中对患者9的随访显示,在A1762T+G1764A双变异保持不变的情况下,T1753C的恢复与出现伴随着MELD评分的下降与升高,并且T1753C出现与恢复均较快,进一步说明T1753C变异可能与ACLF相关。但T1753V单独变异或其他位点联合变异不仅出现在ACLF组,而且在CHB组亦能检测出,T1753V变异的意义还需要进一步的探究。
G1896A、G1899A、G1896A+G1899A、G1896A+G1899A+A1762T+G1764A、A1762T+G1764A+G1896A变异在ACLF组与CHB组间差异也具有统计学意义。随访结果显示,MELD评分的下降伴随着G1896A/G1899A变异位点的消失。有报道显示,1896位核苷G到A的变异,导致28位密码子TGG(色氨酸)变异为终止密码子TAG,使前C蛋白的翻译中止,从而使HBeAg不能形成,与A1762T/G1764A双突变的联合变异可能引起更严重的肝脏疾病。前C区、BCP区的突变可以导致乙型肝炎病毒感染的持续;其也可以中止或者减少HBeAg的合成,且同时增加核苷酸nt1847-1917茎环结构的稳定性,上调HBcAg的表达,使HBcAg在肝细胞内分布由核型转为胞质型,加重了其对肝细胞的损害。也有研究者认为联合突变的影响高于单纯的双联突变,联合突变可能在ACLF的发生和发展中起着重要的作用。
对患者7、8随访发现,在MELD评分显著下降的同时,伴有A1846T变异位点的消失。A1846T突变亦可抑制HBeAg表达,也可能是促进疾病进展的原因之一。当G1846T变异位点恢复后对HBeAg合成的抑制减弱,利于病情的恢复。但对患者6的随访,患者病情好转,A1846T却持续存在。这种不一致的现象可能是由于G1896A变异位点引起的。患者10随访初期出现了G1896A、G1899A、A1846T位点的变异,随病情恢复,上述变异位点恢复,进一步证明了上述变异位点可能与ACLF的发生有关。A1846T变异的生物学意义还需要进一步的分析研究。
我们的实验结果显示,ACLF患者乙型肝炎病毒前C区/BCP区变异频率高于CHB患者,且联合变异、前C区变异更常见于ACLF患者。对ACLF患者的随访表明,G1899A、A1846T、T1753V随着病情的好转而恢复,上述变异位点可能对ACLF患者病情有一定的影响。但由于随访时间有限,并不能排除其他变异位点对ACLF病情发展的作用。变异引起ACLF的机制还需要进一步的探讨,进行大样本、长时间的动态研究是必要的。
以上来源:马晓艳,韩涛,裴彦祯,赵振刚,高英堂,李莹,景丽。《乙型肝炎病毒前C区/BCP区变异与慢加急性肝衰竭的关系》。《中华肝脏病杂志》2012年9月第20卷第9期