血管性痴呆(VD)是由各种原因引起的慢性脑灌注不足所致的认知功能障碍, 海马CA1区是缺血缺氧最敏感的部位,N-甲基-D-天(门)冬氨酸受体(NMDAR)1(NR1)是NMDAR的功能亚基,代表NMDA分布。安理申是近年来用于治疗血管性痴呆的胆碱酯酶抑制剂。本研究通过建立拟血管性痴呆模型,采用对照研究的方法观察实验动物海马CA1区神经细胞形态学变化、NR1表达和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)、过氧化氢酶(CAT)的活力,探讨安理申神经保护机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物及分组 雄性SD大鼠48只(购自郑州大学实验动物中心),质量(400±50)g,随机分为假手术组、血管性痴呆对照组和安理申组,每组16只。
1.1.2 主要仪器及试剂 MG2 Y型迷宫(张家港市生物医学仪器厂);NR1免疫组化试剂盒(博士德生物工程有限公司);GSHPX、CAT试剂盒(南京建成生物工程研究所);安理申(卫材中国药业有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 模型制备及药物干预 将大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰卧固定在手术台上,常规消毒,颈正中切口,分离双侧颈总动脉(CCA)。血管性痴呆对照组和安理申组腹腔注射硝普钠(2.5 mg/kg,用无菌蒸馏水溶解),随即将双侧颈总动脉夹闭、再通、再夹闭各10分钟后再通,缝合伤口,放回笼中保温饲养。假手术组不阻断双侧颈总动脉,不注射硝普钠,余操作过程相同。造模过程中保持动物肛温在37℃左右,以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。大鼠完全清醒4小时后,安理申组给予安理申1 mg/kg(溶解于生理盐水中)、假手术组和血管性痴呆对照组给予生理盐水1 ml灌胃,每日1次共30天。
1.2.2 Y型迷宫试验 术后第25天行迷宫测试,先将大鼠放入迷宫中适应3~5分钟,然后以无规则次序变换安全区,以训练大鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力。大鼠受电击逃到安全区后以大鼠所在支臂作为下一次测试的起始位置,每个实验日在固定时间(下午5~8点)对每只大鼠进行20次训练,连续5天。以大鼠在足底通电后10秒内一次性跑向安全区为正确反应,否则为错误反应;全天完成所有反应所需时间称为全天总反应时间 (TRT)。每日出现错误反应次数(EN)≤2次、TRT≤120秒作为判定大鼠学习记忆的标准。
1.2.3 NR1表达水平检测 术后第30天行为学测试完毕后每组随机选取8只大鼠麻醉后经心脏灌注内固定取脑,在鼠脑最宽部位(海马冠状位)取厚度为3毫米的脑片,置4%多聚甲醛溶液中固定24小时,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋,连续冠状切片,片厚约5微米,每只大鼠取5张切片,分别进行HE染色及SP免疫组化染色检测NR1表达水平,实验步骤严格按说明书进行。采用Qwin 550 CW图像处理与分析系统,每张切片同一区域中,随机选取8个视野,检测面积大致相同,采集8组数据,取均值作为该切片NR1的平均灰度值。
1.2.4 GSHPX、CAT活力测定 各组另外8只大鼠麻醉后断头,冰盘上取脑,小心剥离海马,按标本质量用生理盐水配成10%的脑匀浆,低温、3500 转/分钟、离心10分钟,取上清液,按GSHPX、CAT试剂盒说明操作测出光密度(OD)值,考马斯亮蓝检测标本蛋白质含量并计算酶活力。OD值越高,酶活力越低。
1.2.5 统计学方法 数据以均值±标准差(±s)表示,使用SPSS 10.0统计软件,两样本均数间比较采用t检验,组间均数的显著性检验用单因素方差分析,满足正态分布及方差齐性要求时采用LSD法,不满足方差齐性要求时, 则采用DunnettC法。
2 结 果
2.1 各组大鼠学习记忆成绩的比较 与血管性痴呆对照组比较,假手术组和安理申组EN明显减少,TRT明显缩短(均P〈0.01),假手术组和安理申组间差异无统计学意义。
2.2 各组脑组织形态学改变的比较 HE染色可见假手术组大鼠海马CA1区神经细胞数目多,排列紧密、均匀而整齐,胞核呈圆形或椭圆形,核仁明显,染色质均匀;血管性痴呆对照组海马CA1区神经细胞结构松散、数目减少、排列紊乱,胞核深染、固缩,核仁消失,胞浆周围发现空晕,胞间距较大,并可见大量形态不规则的胶质细胞及散在胶质细胞增生小结,仅见少量正常神经细胞;安理申组海马CA1区可见较多的正常神经细胞,排列较密,胞核圆或椭圆形,核仁清晰,染色质丰富,少见固缩变性的神经元。
2.3 各组NR1分布及免疫灰度值的比较 假手术组海马CA1区层次清、排列紧密,可见NR1阳性神经元胞膜呈黄色,胞浆较淡,胞体大、圆或椭圆形;血管性痴呆对照组海马CA1区层次减少,排列稀疏,残余的NR1阳性神经元胞膜呈深棕黄色,并可见胞核着色;安理申组海马CA1区神经元数目明显增多,层次清晰,排列较密,NR1阳性神经元明显减少且染色淡黄。NR1阳性神经元免疫反应灰度值假手术组与血管性痴呆组间差异无统计学意义,且显著低于血管性痴呆对照组(均P〈0.01)。
2.4 各组GSHPX、CAT活力(OD)的比较 血管性痴呆对照组GSHPX、CAT的OD值显著低于安理申组及假手术组(P〈0.05~0.01);安理申组与假手术组间GSHPX、CAT OD值差异无统计学意义(P>0.05)。
3 讨 论
本实验结果发现,血管性痴呆对照组神经细胞结构松散、数目及层次减少、排列稀疏,残余的NR1阳性神经元表达显著增高,表现为胞膜着色明显加重,呈深棕黄色,并可见胞核着色,GSHPX、CAT活力显著低于假手术组和安理申组;安理申组神经元数明显增多,层次清、排列较密,NR1阳性神经元明显减少且染色淡黄,仅有部分神经元着色,GSHPX 、CAT活力较血管性痴呆对照组有较明显地提高。表明安理申对缺血缺氧的神经元有较显著的保护作用,其机制可能为:(1)拮抗NMDAR,主要是下调NR1的表达,来阻断由其引发的钙超载,进而阻断一系列导致神经元损伤的级联反应;(2)提高抗氧化酶GSHPX和CAT的活性,对抗过氧化氢导致的神经元损伤。
Akasofu 等的研究发现,安理申对处于缺血缺氧环境下的原代培养神经元预处理12小时后,可拮抗NMDA释放和海人酸的释放,进而降低钙的浓度,减少细胞内钙超载,并减少由其引发的乳酸脱氢酶的释放,从而减轻神经元损伤。有研究发现安理申可改善缺血脑组织的代谢、对抗细胞凋亡而起到保护神经元的作用。
来源:《临床神经病学杂志》 2007年06期 作者;樊素琴 刘合玉 杨伟民 邢陆伟 闫丙川