慢性荨麻疹(chronic urticaria)病因复杂,部分患者发病与自身免疫有关,但具体机制尚未完全明确。有研究表明,慢性荨麻疹患者血清中补体参与了嗜碱粒细胞或肥大细胞组胺释放、白三烯等炎症介质活化过程,红细胞补体受体是1(complement receptor type1,CR1)即红细胞C3b/C4b受体,是补体受体中的重要成员,亦是红细胞天然免疫的重要基础。我们检测了慢性慢性荨麻疹患者和健康人外周红细胞CR1及IgE、 C3、C4和CH50的含量,初步探讨红细胞天然免疫在慢性荨麻疹的表达与健康对照组是否存在差异。
对象与方法
2010年6月至2011年6月在广州军区武汉总医院皮肤性病科门诊就诊的慢性荨麻疹患者59例,其中人工划痕症14例,慢性特发性荨麻疹45例;男39例,女29例,平均年龄34.3(18~45)岁。入选标准:患者1周内未使用过抗阻胺药物,1个月内未用过糖皮质激素及其他免疫抑制剂;无湿疹、接触性皮炎、过敏性皮炎等过敏性疾病病史;近期无局部及全身感染。另选本院健康体检者全血29例,其中男16例,女13例,平均年龄36.2(20~50)岁。两组间性别、年龄分布差异无统计学意义。本实验已经广州军区武汉总医院伦理委员会审核通过。
二、主要试剂盒仪器
FACS Calibur流式性别仪(美国Becton Dickinson公司),雷杜RT—6000酶标仪(上海伍可工贸有限公司),CX4贝克曼全自动化分析仪(美国Beckman Coulter公司),鼠抗人CR1(CD35)单克隆抗体、免抗属IgG—FITC(圣克鲁斯生物技术上海有限公司),CH50 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。
三、方法
1、标本采集及处理:研究对象均于早晨空腹菜跗
静脉血5ml,其中3ml全血放于肝素抗凝管中,4 °c冰箱保存,待流式细胞仪检测;另2ml置于干燥管中,2500r/min低温离心15min,,吸取上清液,置于-20°c保存待检。
2、CR1表达检测:10µl抗凝血用磷酸盐缓冲液(PSC)作1:200稀释后,在干净的微量离心管中加入1mlPSB、20µl一抗(鼠抗人CR1抗体)、100µl、稀释的抗凝血,37°c乳育30min,1000r/min离心40min。弃上清液,用PBS洗涤离心3次,在沉淀的红细胞中加入1mlPBS及20µl二抗(兔抗鼠IgG—FITC),37°c乳育30min。洗涤3次后加入PBS1ml,上流式细胞仪检测10000个红细胞表面的荧光强度。
3、血清CH50测定:取血清分离后上清夜,96孔酶标板每孔加入稀释好的标准品50µl于反应孔、血清10µl于反应孔内,标准孔按试剂盒说明书操作。轻轻振荡摇匀,37°c温育1h。洗涤5次后加酶标抗体每孔50µl,37°c温育30min后洗涤5次。加入显色剂避光显色15min。在45nm处测定各孔的A值,并由酶标仪软件读出浓度值。浓度×稀释倍数即为样本CH50的含量。
4、血清IgE及C3\C4测定:采取双抗体夹心ELISA法。
四、统计学处理
采用CPSS13.0统计软件包,健康对照组、人工划痕症组与慢性特发性荨麻疹组三组间样本均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),健康对照组与慢性荨麻疹组三组间均数的比较采用独立样本t检验。相关分析采用Pearson。
结果
一、 外周血红细胞CR1的表达
健康对照组与慢性特发性荨麻疹组、人工划痕症组间外周血红细胞CR1的表达行one-way ANOVA分析,F=10.19,P=0.01,3组差异有统计学意义(p<0.01)。健康对照组与慢性荨麻疹组间独立样本t检验,t=4.10,p<0.01。
二、 外周血IgE水平检测
健康对照组与人工划痕症组、慢性特发性荨麻疹组外周血IgE水平差异有统计学意义(P<0.05),人工划痕组与慢性特发性荨麻疹组间差异有统计学意义(P<0.05)。
三、 慢性特发性荨麻疹血清IgE总C3、C4和CR1的相关性分析
将慢性特发性荨麻疹患者按IgE含量分为3组,IgE<240µg/L组22例,其中CR1为24.45±10.83;IgE240~500µg/L组20例,CR1为33.09±11.86。采用one-way ANOVA分析,F=3.94,P<0.05;LSD法进行两两比较,IgE<240µg/L组与>500µg/L CR1组差异有统计学意义(p<0.01)。慢性荨麻疹患者血清总IgE与CR1呈显著,正相关(r=0.27,P<0.05),CR1与血清C3(r=0.16)、C4(r=-0.08)无显著相关性(P值均>0.05),C3与C4呈正相关(r=0.54,p<0.01)。3组C3、C4和CH5水平经one-way ANOVA检验,差异均无统计学意义(P值均>0.05)。
讨论
天然免疫与获得性免疫网咯关系是当前免疫学的热点研究之一。红细胞已被证实是体内数量最多的一种天然免疫细胞,参与T淋巴细胞、LAK细胞、NK细胞、吞噬细胞的免疫功能的调节,在机体免疫反应和疾病发生发展中都具有十分重要的意义。CR1除分布于红细胞外,还分布于粒细胞、单核细胞、肥大细胞、绿泡树突细胞、贤小球足突细胞、B细胞及部分CD T细胞等。血循环中85%的CR1都存在于红细胞膜上,具有多种免疫作用,参与补体活化调节。
CR1(CD35)是相对分子质量为180000~260000的单链多态性跨膜糖蛋白,属于补体激活调节因子家族成员,是血红细胞免疫功能最重要的物质基础之一,其表达的高低直接影响循环免疫复合物(CIC)的清除。表达越多者活跃越高,清除CIC能力也越强表达越多者活性越高,清除CIC能力也越强,其表达形式由CR数量基因多态性(Hindl多态性)遗传决定,也受后天多种因素影响。大量研究表明,大多数免疫相关疾病患者CR1分子与CIC的结合力及红细胞膜上CR1分子是下降的,如肿瘤、类风湿性关节炎已经系统性红斑狼疮。提示红细胞CR1的减少将引起免疫复合物储存、运输障碍,可能是自身免疫性疾病发病和使病情加重原因之一。
本实验结果表明,健康对照组与人工划痕症组、慢性特发性荨麻疹组外周血红细胞CR1的表达差异有统计学意义,说明慢性荨麻疹患者血清中CR1表达较健康对照组高,此结果与白杰明等的研究相一致。提示CR1可能参与慢性荨麻疹的发生,红细胞CR1分子数量及其活性的增加,可能是慢性荨麻疹患者红细胞天然免疫功能存在亢进和紊乱。
在此基础上我们观察到,慢性荨麻疹患者血清IgE与红细胞CR1呈显著正相关,且慢性荨麻疹患者IgE<240µg/L组与>500µg/L组间CR1含量差异有统计学意义。表明当CR1表达增高到一定程度时,IgE含量升高。当致病原抗原进入血液后,首选溶于血浆并被补体调理,被血红细胞上为数众多的补体受体CR1(CD35)所黏附,通过红细胞上的CD58、CD59与淋巴细胞CD2共刺激分子相结合,进而激活并促进淋巴细胞等适应性免疫细胞产生免疫效益应。
CR1分子的数量既与先天基因表达有关,又受后天影响。先天性的因素主要为疾病本身基因多态性变化,后天性因素主要为自身免疫性疾病严重的程度,特别是CIC产生的速度、数量和持续时间长短。本研究结果表明,红细胞CR1在慢性荨麻疹患者中的表达存在异常,红细胞表面的CR1与IgE之间的关系及病理过程中的调节机制值得进一步深入研究。
(罗颖等,慢性荨麻疹患者红细胞补体受体1分子表达及外周血IGE和补体C3\C4水平的相关性研究[J]中安皮肤科杂志2012年12月第45卷第12期)