环孢素A(新山地明,Cyclosporin A,CsA)自20世纪70年代应用于临床以来,作为免疫抑制剂发挥了极其重要的作用;环孢素A(新山地明)是目前公认的抑制移植排斥反应最为有效的药物。环孢素A(新山地明)对某些自身免疫性疾病的治疗亦已取得一定的疗效。正常生理妊娠类似于同种异体移植,胚胎作为自然的同种移植物不受母体免疫排斥是免疫排斥现象的唯一例外,实际上反映母体对胚胎的免疫耐受。而妊娠失败多因母体对胚胎的免疫排斥所致。
研究发现,于孕早期(胚胎着床期)腹腔注射CsA,可恢复小鼠妊娠失败模型母—胎界面Th1/Th2/Th3型细胞因子免疫调节的生理平衡,形成维持正常妊娠所需的Th2/3型免疫偏倚,并诱导外周免疫细胞对父系抗原的免疫耐受,使流产模型的妊娠预后达到正常妊娠水平;体外实验证实CsA可刺激人早孕期滋养细胞生长,并改变其细胞形态,使其迁移能力及侵袭性增强。采用抑制性差减杂交法获得在CsA作用于人JAR细胞系后6个高表达基因,其中1个为已知基因,2个为功能未知的mRNA,3个为位于16号染色体上的EST。显然CsA对母胎界面具有良好的调节作用。
滋养细胞携带来自胎儿的外胚层抗原,是母胎界面唯一与母体免疫系统直接接触的胎儿细胞,在母胎免疫耐受中发挥重要作用。许多病理性妊娠,如反复自然流产、妊高征及胎儿宫内生长迟缓等均伴有滋养细胞某些生物学功能异常。以CsA作为研究工具,观察CsA对细胞滋养细胞生物学功能及功能基因表达的影响,并进一步解析其信号转导机制,对于解析CsA新的药效机制,具有重要意义。
环孢素A(新山地明)研究通过原代培养早孕期人细胞滋养细胞及JAR滋养细胞株,在CsA作用下,研究作为自然移植物的细胞滋养细胞生物学功能及功能基因表达的改变及其信号转导机制。为反复自然流产等妊娠疾患的治疗提供线索。
环孢素A(新山地明)对人早孕期细胞滋养细胞的分离、培养及鉴定
目的 环孢素A(新山地明)对建立早孕期人细胞滋养细胞的分离、纯化方法,了解CD133在滋养层细胞的表达情况,为鉴定滋养层细胞株及原代分离的细胞滋养层细胞提供新的细胞内标志。
方法 通过胰蛋白酶/DNase Ⅰ分步消化,Percoll密度梯度离心法分离纯化细胞滋养层细胞,经抗Cytokeratin7、Vimentin单克隆抗体免疫细胞化学和流式细胞术鉴定其纯度。采用三种不同的CD133荧光标记的单克隆抗体在70%的甲醇固定前后对原代分离的细胞滋养层细胞和绒毛膜上皮癌细胞株(JAR)行流式细胞术(FCM)分析。
结果 抗Cytokeratin7、Vimentin单克隆抗体行免疫细胞化学和流式细胞仪鉴定细胞滋养细胞纯度达95%以上。70%甲醇固定前,三种CD133单克隆抗体均不能与滋养层细胞反应;70%甲醇固定后,抗CD133-1(AC133-1-APC)、抗CD133-2(293C3-PE)仍不能与滋养层细胞反应,而抗CD133-2(AC141-PE)与细胞滋养层细胞胞内抗原结合。AC141阳性的细胞也是Cytokeratin7阳性的细胞。
综上所述,胰蛋白酶/DNase Ⅰ分步消化,Percoll密度梯度离心法可简单、快速获得高纯度人早孕期细胞滋养细胞。CD133-2/AC141可作为细胞滋养层细胞鉴定的一种可靠细胞内标志。