临床试验研究环孢素A对早孕期人细胞滋养细胞侵袭与迁移的影响及其信号转导机制。滋养细胞携带来自胎儿的外胚层抗原,是母胎界面唯一与母体免疫系统直接接触的胎儿细胞,在母胎免疫耐受中发挥重要作用。许多病理性妊娠,如反复自然流产、妊高征及胎儿宫内生长迟缓等均伴有滋养细胞某些生物学功能异常。以CsA作为研究工具,观察环孢素A对早孕期人细胞滋养细胞侵袭与迁移的影响,并进一步解析其信号转导机制,对于解析CsA新的药效机制,具有重要意义。
环孢素A对早孕期人细胞滋养细胞侵袭与迁移的影响
目的 探讨环孢素A(新山地明)(Cyclosporin A,CsA)对早孕期人细胞滋养细胞及人滋养细胞肿瘤细胞系JAR侵袭与迁移的调控作用。
方法 应用硅化聚乙酰胺吡咯烷酮(Percoll)密度梯度离心法,分离纯化早孕期人细胞滋养细胞,经免疫细胞化学和流式细胞术鉴定其纯度;采用transwell分析早孕期人细胞滋养细胞及人JAR细胞系迁移及侵袭能力;通过Western blot观察pERK1/2的表达;ELISA分析MAP激酶活性。细胞内共转染AP-1-Luciferase、NFκB-Luciferase、NFAT-Luciferase与Renilla Luciferase-SV40报告质粒采用荧光素酶报告基因双检测系统分析各转录因子的启动子活性。
结果
(1)早孕期人细胞滋养细胞在含0.001,0.01,0.1,1.0μmol/L CsA的细胞培养液中分别培养24h、48h及72h时迁移、侵袭能力均增强;以1.0μmol/L的CsA促进作用最强,其中培养48h,CsA作用最显著。而CsA浓度达10.0μmol/L时,细胞滋养细胞的侵袭能力下降。CsA条件性培养基也能增强细胞滋养细胞的迁移能力与侵袭性,且其作用强于CsA组;CsA及其条件培养基对JAR细胞系有类似的作用。
(2)TGF-β1、TGF-β2可抑制细胞滋养细胞固有的和CsA诱导的侵袭与迁移能力,TGF-β1中和性抗体可增强细胞滋养细胞自身或CsA诱导的侵袭与迁移能力,TGF-β2中和性抗体可增强CsA诱导的细胞滋养细胞侵袭与迁移能力,对细胞滋养细胞自身的侵袭与迁移能力没有明显影响。而无论TGF-β1、TGF-β2或其中和性抗体对于JAR细胞系的侵袭与迁移能力均没有影响。
(3)Western blot、ELISA显示,CsA以时间和剂量依赖方式促进细胞滋养细胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化。U0126预处理可抑制CsA诱导的细胞滋养细胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化。而NFAT抑制剂对CsA诱导的细胞滋养细胞ERK1/2磷酸化和MAP激酶活化无显著影响。
(4)CsA以时间和浓度依赖方式刺激细胞滋养细胞AP1、NF-κB启动子活性;抑制ionomycin+PMA诱导的细胞滋养细胞NFAT启动子活化。
(5)MEK激酶抑制剂U0126以剂量依赖方式抑制滋养细胞ERK1/2磷酸化和MAP激酶活化的同时,抑制AP1、NF-κB启动子活性,抑制细胞滋养细胞固有的和CsA诱导的迁移能力与侵袭性。NFAT抑制剂单独或与CsA合并使用都会促进细胞滋养细胞迁移与侵袭能力。但NFAT抑制剂单独应用作用低于CsA或CsA与NFAT抑制剂合并使用。
结论
(1)CsA呈时间剂量依赖方式活化MAPK/ERK1/2信号通路,促进早孕期人细胞滋养细胞的体外侵袭、迁移能力。
(2)抑制细胞滋养细胞Ca2+/Calcineurin/NFAT信号通路是CsA促进滋养细胞迁移能力与侵袭性的重要机制之一。
(3)CsA诱导的转录因子AP-1、NF-κB活化可能参与CsA对细胞滋养细胞体外生长的调控作用。
(4)AP-1、NF-κB可能是CsA活化的细胞滋养细胞MAPK/ERK1/2信号通路下游的转录因子。
(5)CsA诱导的MAPK/ERK1/2信号活化独立于NFAT核转位以及NFAT转录活性;CsA抑制的NFAT活性也不依赖于MAPK/ERK1/2信号活性。
(6)CsA对细胞滋养细胞的促侵袭、迁移能力可能不是通过TGFβ介导。