环孢素A自20世纪70年代应用于临床以来,作为免疫抑制剂发挥了极其重要的作用;环孢素A(新山地明)是目前公认的抑制移植排斥反应最为有效的药物。环孢素A(新山地明)对某些自身免疫性疾病的治疗亦已取得一定的疗效。正常生理妊娠类似于同种异体移植,胚胎作为自然的同种移植物不受母体免疫排斥是免疫排斥现象的唯一例外,实际上反映母体对胚胎的免疫耐受。而妊娠失败多因母体对胚胎的免疫排斥所致。
环孢素A(新山地明)研究通过原代培养早孕期人细胞滋养细胞及JAR滋养细胞株,在CsA作用下,研究作为自然移植物的细胞滋养细胞生物学功能及功能基因表达的改变及其信号转导机制。为反复自然流产等妊娠疾患的治疗提供线索。
环孢素A(新山地明)对早孕期人细胞滋养细胞增殖与凋亡的影响及其信号转导机制
目的 探讨环孢素A(新山地明)(Cyclosporin A,CsA)对早孕期人细胞滋养细胞及人滋养细胞肿瘤细胞系JAR增殖与凋亡的调控作用。
方法 应用硅化聚乙酰胺吡咯烷酮(Percoll)密度梯度离心法,分离纯化早孕期人细胞滋养细胞,经免疫细胞化学和流式细胞仪鉴定其纯度;采用MTT法评价早孕期人细胞滋养细胞及人JAR细胞系活力;PCNA-PE单标志流式细胞术分析细胞增殖情况、Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术分析细胞早期凋亡;通过Western blot观察pERK1/2的水平;ELISA分析MAP激酶活性。细胞内共转染AP-1-Luciferase、NF-κB-Luciferase、NFAT-Luciferase与Renilla Luciferase-SV40报告质粒,采用荧光素酶报告基因双检测系统分析各转录因子的启动子活性。
结果
(1)CsA在有效剂量范围内(1×10^-4~1μmol/L)以浓度依赖方式增强早孕期人细胞滋养细胞活力和PCNA表达;以1.0μmol/L的CsA促进作用最强。CsA浓度达10.0μmol/L时,则抑制细胞滋养细胞的增殖活性;对JAR细胞系呈现类似作用。
(2)TGF-β1、TGF-β2抑制细胞滋养细胞基础的及CsA诱导的增殖活力,TGF-β1中和性抗体可增强细胞滋养细胞自身或CsA诱导的增殖活力,TGF-β2中和性抗体可增强CsA诱导的细胞滋养细胞增殖活力,对滋养细胞自身的增殖活力没有明显影响。而无论TGF-β1、TGF-β2或其中和性抗体对于JAR细胞系的增殖活力均没有影响。
(3)早孕期人细胞滋养细胞凋亡率较低,血清饥饿48h后,Annexin V-FITC、PI细胞明显上升,约为20.34±4.18%(P<0.01),提示滋养细胞凋亡明显增加。加用不同浓度CsA处理后,滋养细胞凋亡显著减少,其抑制作用呈剂量依耐关系。当CsA浓度为1.0μmol/L时作用最强,此时细胞滋养细胞早期凋亡率下降至9.54±2.43%(P<0.01)。而CsA浓度达10.0μmol/L时,体外培养的细胞滋养细胞早期凋亡增加至25.7±1.08%。
(4)Western blot、ELISA显示,CsA以时间和剂量依赖性方式促进细胞滋养细胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化。U0126预处理可抑制CsA诱导的细胞滋养细胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化。NFAT抑制剂对CsA诱导的细胞滋养细胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化无显著影响。
(5)CsA以时间和浓度依赖性刺激JAR细胞AP1、NF-κB启动子活性;抑制ionomycin+PMA诱导的JAR细胞NFAT启动子活化。
(6)MEK激酶抑制剂U0126以剂量依赖方式抑制滋养细胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化的同时,抑制AP1、NF-κB启动子活性,抑制细胞滋养细胞固有的和CsA诱导的体外增殖能力及PCNA表达;抑制CsA对血清剥夺诱导的细胞滋养细胞凋亡的保护作用。NFAT抑制剂对细胞滋养细胞的增殖、凋亡无明显影响。
结论
(1)CsA呈时间剂量依赖方式活化MAPK/ERK1/2信号通路,促进早孕期人细胞滋养细胞的体外增殖活性与PCNA表达、抑制细胞凋亡。
(2)CsA可抑制滋养细胞Ca^2+/Calcineurin/NFAT信号通路,但此通路不参与CsA对滋养细胞的保护作用。
(3)CsA诱导的转录因子AP-1、NF-κB活化可能参与CsA对细胞滋养细胞体外生长的调控作用。
(4)AP-1、NF-κB可能是CsA活化的细胞滋养细胞MAPK/ERK1/2信号通路下游的转录因子。
(5)CsA诱导的MAPK/ERK1/2信号活化独立于NFAT核转位以及NFAT转录活性;CsA抑制的NFAT活性也不依赖于MAPK/ERK1/2信号活性。
(6)CsA对细胞滋养细胞的促增殖能力可能不是通过TGFβ介导。
来源期刊:《分子细胞生物学报》2007年 第1期 作者:周雯慧 杜美蓉 董琳 朱晓勇 贺银燕 李大金